Projekthintergrund

In den späten 1980er Jahren etablierte sich das Laser-Konfokalmikroskop als weltweit fortschrittlichste Technik der biologischen Fluoreszenzbildgebung und fand breite Anwendung in diesem Bereich. Allerdings wies es einen Nachteil auf: Die konfokale Apertur blockierte nicht nur die Fluoreszenz außerhalb des Fokuspunktes, sondern auch die Streufluoreszenz des biologischen Gewebes. Dies führte zu einer verringerten Fluoreszenzerfassungseffizienz und begrenzte die Bildgebungstiefe auf wenige hundert Mikrometer. Daher wurde in den 1990er Jahren die Zwei-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie entwickelt, die Laser-Konfokalmikroskopie mit Zwei-Photonen-Anregungstechnologie kombiniert. Die Anregungswellenlänge im Zwei-Photonen-Absorptionsprozess liegt stets im biologischen Fensterbereich von 680–1080 nm, wodurch die Schädigung von Zellen oder lebenden Organismen durch UV-Licht vermieden und eine tiefere Eindringtiefe ermöglicht wird.

Derzeit werden Femtosekunden-Ti:Saphir-Laser häufig in Zwei-Photonen-Fluoreszenzmikroskopen eingesetzt. Ihre Größe und der hohe Preis schränken jedoch die Entwicklung dieser Bildgebungstechnologie in den Lebenswissenschaften, der Chemie und der Medizin ein. Daher werden Subnanosekunden-Festkörperlaser mit kompakter Bauweise und günstigem Preis als Standard-Laserquellen in Anwendungen wie der medizinischen Diagnostik verwendet.

 Unterschied zwischen konfokaler Mikroskopie und Zwei-Photonen-Fluoreszenz-Bildgebung

Einführung in die Theorie

Die grundlegende Theorie der Zwei-Photonen-Anregung: Bei hoher Photonendichte absorbieren die angeregten Fluoreszenzmoleküle zwei langwellige Photonen und kehren nach Anregung und Schwingungsrelaxation durch spontane Fluoreszenzemission in den Grundzustand zurück. Im Vergleich zur herkömmlichen Fluoreszenzmikroskopie mit Ein-Photonen-Anregung ist das optische Signal der Zwei-Photonen-Anregung nichtlinear. Das Anregungslicht stammt von einer Laserquelle mit langer Wellenlänge und hoher Spitzenleistung, wobei die Emissionswellenlänge des Fluoreszenzphotons etwas länger als die Hälfte der Anregungswellenlänge ist.

Diagramm des Zwei-Photonen-Anregungsprozesses    Theoriediagramm der Zwei-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie

Technologie und Funktionen

Die Zwei-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie nutzt eine Nahinfrarot-Laserquelle und benötigt aufgrund ihrer nichtlinearen Eigenschaften keine konfokale Apertur. Im Vergleich zur konfokalen Mikroskopie bietet die Zwei-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie daher folgende Vorteile:

Größere Bildgebungstiefe und geringere optische Schäden;

Eine konfokale Apertur ist nicht erforderlich, und die Fluoreszenzerfassungseffizienz wird deutlich verbessert;

Hohe räumliche Auflösung und hohes Kontrastverhältnis;

Kleiner Anregungsbereich, Phototoxizität und Albifaktion;

Zwischen Emissionswellenlänge und Anregungswellenlänge besteht ein großer Abstand, wodurch eine spektrale Überlappung vermieden wird;

Produkte und Dienstleistungen

Im Bereich der Zwei-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie bietet Reallight verschiedene Subnanosekunden-Mikrochip-Laser mit geringer Größe, Einzelmodenbetrieb und hoher Spitzenleistung an, um den unterschiedlichen Anforderungen von Kunden in den Bereichen Biowissenschaften, analytische Chemie und klinische Medizin gerecht zu werden. Darüber hinaus fertigt Reallight kundenspezifische Laserquellen.

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