Contexto do projeto

No final da década de 1980, como a técnica de imagem de fluorescência biológica mais avançada do mundo, o microscópio confocal a laser foi amplamente aplicado na área de imagem de fluorescência de materiais biológicos. No entanto, o microscópio confocal a laser apresenta uma desvantagem: a abertura confocal não apenas bloqueia a fluorescência fora do ponto focal, mas também a fluorescência dispersa do tecido biológico produzida pelo ponto focal. Isso leva à diminuição da eficiência de coleta de fluorescência e a uma profundidade de imagem limitada a centenas de micrômetros. Assim, na década de 1990, surgiu a tecnologia de microscopia de fluorescência de dois fótons, que combina o microscópio confocal a laser com as tecnologias de estimulação de dois fótons. O comprimento de onda de estimulação no processo de absorção de dois fótons é sempre definido na faixa da janela biológica, entre 680 e 1080 nm, o que evita danos da luz UV às células ou organismos vivos e permite uma penetração mais profunda.

Atualmente, o laser de titânio-safira de femtosegundo é amplamente utilizado em microscopia de fluorescência de dois fótons, mas seu grande tamanho e alto custo limitam o desenvolvimento da tecnologia de imagem por microscopia de fluorescência de dois fótons em ciências da vida, química e aplicações médicas. Portanto, o laser de estado sólido subnanossegundo, com design compacto e preço acessível, é aplicado como fonte de laser padrão em aplicações como diagnóstico médico.

 Diferença entre a estrutura da imagem obtida por microscopia confocal e a imagem por fluorescência de dois fótons

Introdução à teoria

A teoria básica da excitação por dois fótons: Em alta densidade de fótons, quando uma molécula fluorescente é estimulada, os fótons absorvem dois comprimentos de onda longos e, em seguida, retornam ao estado fundamental após a transição de excitação e o relaxamento vibracional, emitindo um fóton de fluorescência espontânea. Comparado com a microscopia de fluorescência tradicional por excitação de um único fóton, o sinal óptico da microscopia de fluorescência por excitação de dois fótons é não linear. A luz de estimulação é proveniente de uma fonte laser com comprimento de onda longo e alta potência de pico, e o comprimento de onda de emissão do fóton de fluorescência é um pouco maior que a metade do comprimento de onda de excitação.

Diagrama do processo de excitação de dois fótons     Diagrama da teoria de imagem por microscopia de fluorescência de dois fótons

Tecnologia e funcionalidades

A técnica de microscopia de fluorescência de dois fótons utiliza uma fonte de laser no infravermelho próximo e não requer abertura confocal devido às suas características não lineares. Comparada à microscopia confocal, a técnica de microscopia de fluorescência de dois fótons apresenta as seguintes vantagens:

Maior profundidade de imagem e menor dano óptico;

A abertura confocal não é necessária e a eficiência de coleta de fluorescência é bastante aprimorada;

Alta resolução espacial e taxa de contraste;

Pequeno alcance de excitação, fototoxicidade e albifacção;

Existe uma grande distância entre o comprimento de onda de emissão e o comprimento de onda de excitação, o que evita a sobreposição espectral;

Produtos e serviços

Na área de microscopia de fluorescência de dois fótons, a Reallight oferece diferentes tipos de lasers de microchip subnanossegundos com tamanho reduzido, modo longitudinal único e alta potência de pico, para atender às diversas necessidades dos clientes nas áreas de ciências da vida, química analítica e medicina clínica. Além disso, a Reallight também fornece fontes de laser personalizadas, adaptadas às necessidades de cada cliente.

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