Contexte du projet

À la fin des années 1980, le microscope confocal laser, technique d'imagerie par fluorescence biologique de pointe, s'est largement imposé dans le domaine de l'imagerie de matériaux biologiques. Cependant, il présente un inconvénient majeur : l'ouverture confocale bloque non seulement la fluorescence en dehors du point focal, mais aussi la fluorescence diffusée par les tissus biologiques au niveau de ce point. Il en résulte une diminution de l'efficacité de la collecte de fluorescence, et la profondeur d'imagerie ne dépasse pas quelques centaines de micromètres. C'est pourquoi, dans les années 1990, est apparue la technologie de la microscopie à fluorescence biphotonique, qui combine le microscope confocal laser et la stimulation biphotonique. La longueur d'onde de stimulation, lors de l'absorption biphotonique, est toujours fixée dans la fenêtre biologique (680-1080 nm), ce qui évite les dommages causés par les UV aux cellules et permet une pénétration plus profonde.

Actuellement, le laser titane-saphir femtoseconde est largement utilisé en microscopie à fluorescence biphotonique, mais sa taille importante et son coût élevé limitent le développement de cette technologie d'imagerie dans les sciences de la vie, la chimie et les applications médicales. C'est pourquoi le laser à semi-conducteurs subnanoseconde, compact et abordable, est privilégié comme source laser standard dans des applications telles que le diagnostic médical.

 Différence entre l'imagerie par microscopie confocale et l'imagerie par fluorescence à deux photons (structure)

Introduction à la théorie

Théorie de base de l'excitation à deux photons : en présence d'une forte densité de photons, lorsqu'une molécule fluorescente est stimulée, les photons absorbent deux longueurs d'onde importantes, puis retournent à leur état fondamental après émission spontanée de photons de fluorescence, suite à une transition d'excitation et une relaxation vibrationnelle. Contrairement à l'imagerie par microscopie de fluorescence classique à excitation monophotonique, le signal optique de l'imagerie par microscopie de fluorescence à excitation biphotonique est non linéaire. La lumière de stimulation est une source laser de grande longueur d'onde et de forte puissance crête, et la longueur d'onde d'émission des photons de fluorescence est légèrement supérieure à la moitié de la longueur d'onde d'excitation.

Diagramme du processus d'excitation à deux photons    Schéma théorique de l'imagerie par microscopie à fluorescence à deux photons

Technologie et fonctionnalités

La technique d'imagerie par microscopie à fluorescence biphotonique utilise une source laser proche infrarouge et ne nécessite pas d'ouverture confocale grâce à ses caractéristiques non linéaires. Comparée à la microscopie confocale, elle présente ainsi les avantages suivants :

Profondeur d'imagerie accrue et dommages optiques réduits ;

L'ouverture confocale n'est pas nécessaire et l'efficacité de la collecte de fluorescence est grandement améliorée ;

Haute résolution spatiale et rapport de contraste ;

Plage d'excitation réduite, phototoxicité et albifaction ;

Il existe une grande distance entre la longueur d'onde d'émission et la longueur d'onde d'excitation, ce qui évite le chevauchement spectral ;

Produits et services

Dans le domaine de la microscopie à fluorescence biphotonique, Reallight propose différents types de lasers à micropuce subnanosecondes, compacts, monomodes longitudinaux et à haute puissance de crête, afin de répondre aux exigences variées de ses clients en sciences de la vie, chimie analytique et médecine clinique. Reallight peut également fournir des sources laser sur mesure.

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