Contesto del progetto

Alla fine degli anni '80, il microscopio confocale laser, considerato la tecnica di imaging a fluorescenza biologica più avanzata al mondo, è stato ampiamente utilizzato nel campo dell'imaging a fluorescenza di materiali biologici. Tuttavia, il microscopio confocale laser presenta uno svantaggio: l'apertura confocale non solo blocca la fluorescenza al di fuori del punto focale, ma anche la fluorescenza diffusa del tessuto biologico prodotta dal punto focale stesso. Ciò comporta una riduzione dell'efficienza di raccolta della fluorescenza e la profondità di imaging non può superare le centinaia di micrometri. Pertanto, negli anni '90 è emersa la tecnologia del microscopio a fluorescenza a due fotoni, che combina il microscopio confocale laser con la tecnologia di stimolazione a due fotoni. La lunghezza d'onda di stimolazione nel processo di assorbimento a due fotoni è sempre impostata nell'intervallo della finestra biologica, ovvero tra 680 e 1080 nm, il che evita i danni della luce UV alle cellule o agli organismi viventi e consente una penetrazione più profonda.

Attualmente, i laser a zaffiro di titanio a femtosecondi sono ampiamente utilizzati nei microscopi a fluorescenza a due fotoni, ma le loro grandi dimensioni e l'elevato costo ne limitano lo sviluppo nelle scienze biologiche, nella chimica e nelle applicazioni mediche. Pertanto, i laser a stato solido a sub-nanosecondi, grazie al loro design compatto e al prezzo accessibile, vengono impiegati come sorgenti laser standard in applicazioni come la diagnostica medica.

 Differenza tra la struttura dell'imaging al microscopio confocale e quella dell'imaging a fluorescenza a due fotoni

Introduzione alla teoria

La teoria di base dell'eccitazione a due fotoni è la seguente: in presenza di un'elevata densità di fotoni, quando una molecola fluorescente viene stimolata, i fotoni assorbono due lunghezze d'onda lunghe, per poi tornare allo stato fondamentale a partire da un fotone di fluorescenza emesso spontaneamente, dopo la transizione di eccitazione e il rilassamento vibrazionale. Rispetto alla tradizionale microscopia a fluorescenza con eccitazione a singolo fotone, il segnale ottico della microscopia a fluorescenza con eccitazione a due fotoni è non lineare. La luce di stimolazione è una sorgente laser con lunghezza d'onda lunga e alta potenza di picco, e la lunghezza d'onda di emissione del fotone di fluorescenza è leggermente superiore alla metà della lunghezza d'onda di eccitazione.

Diagramma del processo di eccitazione a due fotoni     Diagramma della teoria dell'imaging al microscopio a fluorescenza a due fotoni

Tecnologia e funzionalità

La tecnica di imaging a fluorescenza a due fotoni utilizza una sorgente laser nel vicino infrarosso e, grazie alle sue caratteristiche non lineari, non richiede un'apertura confocale. Rispetto alla microscopia confocale, la tecnica di imaging a fluorescenza a due fotoni presenta quindi i seguenti vantaggi:

Maggiore profondità di campo e minori danni ottici;

Non è necessaria l'apertura confocale e l'efficienza di raccolta della fluorescenza risulta notevolmente migliorata;

Elevata risoluzione spaziale e rapporto di contrasto;

Intervallo di eccitazione ridotto, fototossicità e albifatazione;

Esiste una grande distanza tra la lunghezza d'onda di emissione e la lunghezza d'onda di eccitazione, il che evita la sovrapposizione spettrale;

Prodotti e servizi

Nel campo della microscopia a fluorescenza a due fotoni, Reallight offre diverse tipologie di microlaser sub-nanosecondi di piccole dimensioni, a singola modalità longitudinale e ad alta potenza di picco, per soddisfare le diverse esigenze dei clienti nei settori delle scienze biologiche, della chimica analitica e della medicina clinica. Inoltre, Reallight è in grado di fornire sorgenti laser personalizzate, realizzate su misura per i clienti.

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